Neuroprotective effects of S-allyl-L-cysteine against ischemic damage in in vitro and in vivo models

Abstract

S-Allyl-L-cysteine (SAC), an active organosulfur compound derived from garlic, had an antioxidant effect as a radical scavenger. Recently, it has been shown to attenuate brain ischemic damage by inhibiting lipid peroxidation. Thioallyl group of organosulfur compounds are thought to be responsible for neurotrophic activity in neurons. However, studies related to antioxidant properties of SAC were controversial and the exact mechanisms underlying the neuroprotective effect of SAC are not yet fully understood. The aim of this research was to investigate (i) the effect of SAC on neuroprotection and its mechanism in cerebral ischemic insults; (ii) the structure-activity relationship of organosulfur compounds on neuroprotection and antioxidant activity. In in vivo study, SAC (300 mg/kg, i.p.) significantly decreased the infarct size in both focal and global ischemic models, transient middle cerebral artery occlusion in rats and two-vessel occlusion in gerbil, respectively. In in vitro model, SAC at low micromolar (<10 mM) concentrations significantly scavenged the ONOO-, which was generated in cultured mixed glial cells co-treated with immunostimulants and glucose deprivation. Similar results were obtained by immunohistochemical studies. Our further study showed that SAC effectively inhibited ONOO--induced oxidation of dihydrorhodamine-123. Unlike ONOO-, however, scavenging of H₂O₂, NO, and O₂- was observed only at high micromolar or low millimolar concentrations of SAC. The activity of extracellular signal-regulated kinase (ERK), one family of mitogen-activated protein kinases, was increased by oxygen-glucose deprivation in cultured cerebral cortex neurons as well as by transient middle cerebral artery occlusion in rats. We found that SAC significantly inhibited the activation of ERK, which was mimicked by the ERK inhibitors U0126. The results indicate that SAC may exert its neuroprotective effect on cerebral ischemic insults by scavenging ONOO- as well as inhibiting the ERK signaling pathway. To determine the effects of dietary SAC on the development of stroke, salt-loaded stroke-prone spontaneously hypertensive (SHRSP) and normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats were divided into 4 groups: (1) SHRSP-control; (2) SHRSP-SAC; (3) WKY-control; (4) WKY-SAC. All were fed a stroke-prone diet with or without 0.5% SAC and given drinking water containing 1% NaCl for 4 weeks. No difference of blood pressure was observed after SAC supplementation. In the SHRSP-SAC group, the onset of stroke was delayed in parallel with a decrease in the incidence and mortality. The SHRSP-SAC group scored better in the neurological examination than the SHRSP-control group. These results indicate that dietary SAC attenuates the development of stroke in salt-loaded SHRSP rats. The structure-activity relationship of organosulfur compounds on neuroprotection and antioxidant activity was elucidated in this study. Only SAC showed a significant reduction of ischemic injury in global ischemia model. However, not only alliin (ALI), having sulfoxide group together with allyl cysteinyl group, but also diallyl sulfide, diallyl disulfide, and diallyl trisulfide having only thioallyl group didn’t inhibit ischemic damage. In addition, we explored the scavenging activity of these compounds against reactive oxygen species (superoxide, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, peroxynitrite) using in vitro systems. As a result, ALI and SAC possess a very convincing OH- scavenging potential with almost no ability to scavenge O₂- and H₂O₂. In contrast, lipid soluble organosulfur compounds scavenged O2- rather than OH- and H₂O₂. Their O₂- scavenging potential is likely to be related to number of sulfur atoms. The ONOO- was scavenged by all the tested organosulfur compounds except ALI, with the SAC being more active. These scavenging activities of SAC on ONOO- and OH- may be at least in part associated with the reduction of ischemic injury. Thus, it is likely that cysteinyl group attached to the sulfur atom of thioallyl group without sulfoxide explains observed differences in anti-ischemic efficacies and in ROS scavenging activities among organosulfur compounds. Taken together, it is likely that SAC could be used as a diet supplement for the protection of cerebral ischemic damage.;오래 전부터 마늘의 다양한 생리 활성 및 항산화 효과, 항암 효과, 콜레스테롤 저하 및 항혈전효과 등에 관하여 많은 연구가 행해져 왔으며, 마늘로부터 유래된 유기황화합물들이 향신경성 (neurotrophic) 효과를 지닌 것으로 보고되었다. 최근에는 마늘의 수용성 유기황화합물 중 가장 활성이 높은 것으로 알려져 있는 S-allyl-L-cysteine (SAC)가 허혈성 뇌졸중 모델에서 항산화 작용을 통하여 뇌신경손상을 감소시키는 것이 보고되었다. 또한 뇌졸중이 일어나면 산화적 스트레스로 인하여 뇌신경세포가 손상되는데, 다양한 항산화제 및 라디칼 소거제들이 이러한 산화적 손상을 감소시켜 뇌신경 손상을 막을 수 있음이 제시되었다. 본 연구에서는 SAC의 뇌신경보호효과를 확인하고, 그 작용기전을 밝히며, 식이 SAC 보충이 뇌졸중 발병에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한, 유기황화합물들의 항뇌졸중 보호 효과 및 항산화 효과에 관한 구조활성관계를 파악해 보고자 하였다. SAC의 뇌신경보호효과 및 그 작용기전에 관한 연구를 수행하였다. 뇌허혈 유발 모델을 이용하여 SAC를 복강으로 단일 또는 반복투여하므로써 뇌신경보호 효과를 확인하였다. SAC는 immunostimulation and glucose deprivation model에서 peroxynitrite에 의해 유도된 교세포사를 억제하며, peroxynitrite 생성을 억제함을 확인하였다. 활성산소종 (ROS)는 MAPKs를 포함하는 여러 신호 경로를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 뇌졸중 시 생성된 peroxynitrite 등의 라디칼은 MAPKs를 활성화 시킨다. 본 연구에서는 SAC가 oxygen glucose deprivation 시킨 대뇌신경세포 및 국소뇌허혈을 유도한 쥐의 뇌에서 MAPKs 족의 하나인 ERK의 활성을 억제시켰다. 이상의 결과로 보아, SAC는 ERK 신호 경로를 불활성화 시키는 것과 함께 peroxynitrite를 직접 소거하므로써 뇌졸중에 의한 뇌신경세포 손상을 막는 것으로 여겨진다. In vitro와 in vivo에서 밝혀진 SAC의 뇌신경보호 효과 및 그 작용기전에 관한 결과들을 토대로, SAC을 식이로 주었을 때에도 동일한 보호효과를 얻을 수 있는지를 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 salt-loaded stroke-prone spontaneously hypertensive rats에게 0.5% SAC 식이를 4주간 보충하였을 때 뇌졸중 유발 빈도를 대조군 에 비해 22 % 감소시켰으며, 사육기간 동안 대조군에서 33%의 사망률을 보이는데 비해 SAC 보충군에서는 사망 예가 관찰되지 않았다. 뇌졸중 및 신경퇴행 증상을 점수화 하였을 때, SAC 보충군에서는 신경퇴행 증상이 완화 되었다. 유기황화합물들의 허혈성 뇌손상 보호 효과 및 라디칼 소거 효과에 관한 구조활성관계를 알아보았다. 본 연구결과, 마늘로부터 유래된 향신경성 효과를 가지는 유기황화합물인 ALI, SAC, DAS, DADS, DATS 중에서 SAC 만이 뇌신경손상을 막을 수 있었다. 유기황화합물들의 항산화능 및 라디칼 소거능을 살펴보았을 때, 허혈성 뇌손상 보호 효과를 보이는 SAC은 특히 peroxynitrite와 hydroxyl radical을 소거하였으나 비타민 E 아날로그인 Trolox의 항산화능과 비교하는 TEAC 수치는 매우 낮았다. 허혈성 뇌손상 보호 효과와 관련하여 SAC의 구조적 특징인 allyl sulfide group과 cysteinyl group이 peroxynitrite 및 hydroxyl radical을 소거하는데 작용하여 산화적 손상을 막아 뇌신경세포를 보호하는데 관여할 것으로 사료된다. 반면에, SAC에 sulfoxide group이 더하여 질 경우 (ALI) 뇌신경 보호 효과가 상실되는 것으로 나타났다. 이상의 실험결과에서 thioallyl group과 cysteinyl group을 가지는 SAC는 hydroxyl radical과 peroxynitrite를 소거하며, ERK 신호경로를 불활성화 시키므로써 뇌신경보호작용을 갖는 것으로 나타났으며, 뇌졸중의 치료 및 예방을 위한 건강보조식품으로 이용될 가능성이 높은 것으로 사료된다.