Pepsin과 chymotrypsin에 의한 대두단백질 7S globulin 가수분해물의 allergenicity와 allergenic peptides

Abstract

This study was undertaken to investigate the effect of peptic and chymotryptic hydrolysis of 7S globulins on the allergenicity, the major allergen of soybean, and to identify allergenic peptides of 7S globulin. In the isolated 7S globulin we found that β-conglycinin is a trimeric protein composed of three major subunits(α'=76kDa, α=72kDa, β=53kDa) with disulfide bonds between α-subunits. As a result of peptic(2,340U) and chymotryptic(82.5U) hydrolysis of 7S globulin, α'-subunit(76kDa) and α-subunit(72kDa) of the β-conglycinin was effectively hydrolyzed, while β-subunit(53kDa) were not. It may be because of higher content of hydrophobic amino acid and β-sheet of α-subunit's core than α', α-subunits. The peptides of 20-25kD, 10-16kD, and ~6kD molecular weights were obtained through peptic and following chymotryptic hydrolysis of 7S globulin extracts. As a result of ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) performed using sera from 10 soybean-allergenic patients, allergenicity of 7S globulins was higher than 11S globulins and was reduced over 50% by peptic hydrolysis. However, allergenicity of 5 patients sera reduced by peptic hydrolysis was recovered when sequential hydrolysis was performed by chymotrypsin. It may be considered that chymotryptic hydrolysis results in the exposure of closed sequential epitopes of 7S globulin. Hydrolysate of 7S globulin was fractionated using sephacryl S-100 HR and the 10 fractions was obtained. Two fractions showed the high reactivity with sera from 10 soybean-allergenic patients. Molecular weights of them were 20-25kDa, 13-16kDa. The peptides of the lower molecular weights didn't show reactivity with patient's sera. It may be concluded that the exposure of closed sequential epitopes of α'-subunit results in an increase in 7S globulin allergenicity by chymotrypsin with the theoretical hydrolysis of β-conglycinin which is a major protein of 7S globulin;위장관계에서 식품 단백질의 산 변성과 소화는 잠재된 allergenicity를 부분적으로 결정하는 중요한 요소가 된다. 따라서 식품 단백질 자체의 allergenicity 뿐만 아니라 소화·흡수되는 식품 단백질의 fragments의 allergenicity와 residual antigenicity에 대한 정보는 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 대두단백질의 중요 알레르겐인 7S globulin을 분리하여 위장관계의 주요 소화효소인 pepsin과 chymotrypsin이 이의 allergenicity에 미치는 영향을 살피고, 가수 분해된 7S globulin의 fragments에서 알레르겐으로 작용하는 peptides를 확인하였다. 2,340 U의 pepsin과 82.5 U의 chymotrypsin을 통한 7S globulin의 가수분해 결과, β-conglycinin의 α', α-subunits는 완전히 가수 분해되었으나 β-subunit은 강한 저항성을 나타냈으며, TNBS를 이용한 가수분해도는 최종적으로 11%로 나타냈다. SDS-PAGE를 이용한 전기영동을 통해서 7S globulin이 pepsin과 chymotrypsin에 의해 20~25kD, 10~16kD, 6kD이하의 분자량의 갖는 펩타이드로 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 10명의 대두 알레르기 환아 혈청과 1명의 정상 혈청을 이용하여 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)로 확인한 allergenicity는 7S globulin이 11S globulin보다 더 높게 나타났으며, pepsin가수분해에 의해서 7S globulin의 allergenicity가 50%이상 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 pepsin처리 후 chymotrypsin을 재처리한 결과 pepsin에 의해 감소된 allergenicity가 일부 혈청에서 다시 증가하는 것으로 나타나 감추어졌던 IgE epitopes가 다시 노출된 것으로 사료된다. 또한 효소 가수 분해에 의해서도 여전히 부분적으로 allergenicity가 남아있으며, 대두에 대한 감작율이 높은 환자 혈청의 경우에는 가수분해에 의한 allergenicity의 감소 폭이 매우 작게 나타나 가수분해에 의해서도 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. Pepsin(2,340 U)과 chymotrypsin(82.5 U)의 가수 분해물은 gel filtration(Sephacryl S-100 HR)을 이용하여 size에 따라 10개의 fractions로 분리할 수 있었다. 이 중 20~25kDa, 13-16kDa의 peptides가 모든 혈청에서 높은 allergenicity를 나타냈으며, 10-12kDa의 peptides는 대두에 대한 감작율이 높은 환자혈청에 대해서만 반응성이 나타났다. 이보다 더 작은 크기의 peptides에서는 반응성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다. Pepsin과 chymotrypsin 가수분해로 얻을 수 있는 7S globulin, 특히 β-conglycinin을 pepsin과 chymotrypsin 가수분해를 통하여 얻을 수 있는 아미노산 서열을 예측하기 위해 Expert Protein Analysis System(ExPASy)의 ‘Peptide Cutter’ 프로그램을 이용한 결과, 높은 allergenicity를 나타낸 20kDa의 peptides는 β-conglycinin의 α-subunit의 가수 분해물로, 10-16kDa의 peptides는 α'-subunits의 가수 분해물로 예측되었다.