Isolation and Structure Identification of Bioactive Constituents of Zingiber zerumbet

Abstract

Growth factor나 각종 cytokine류에 의해 발현되는 inducible nitric oxide synthase (iNOS)는 체내 항상성 유지 및 염증반응을 통한 체내 방어 작용에 중요한 역할을 하는 nitric oxide (NO)를 생성하는 데에 필수적인 효소이다. 그러나 iNOS가 과발현되면 과잉 생산된 NO에 의해 세포 및 조직 손상이 유발되어 결국에는 세포의 암화를 촉진하게 된다. 따라서, 효과적인 iNOS 저해제는 항 염증제로서 뿐만 아니라 암의 진행 단계를 억제하여 암 발생률을 낮추는 암 예방제로도 적용될 수 있다. 본 연구에서는 lipopolysaccharides (LPS)로 유도된 murine macrophage RAW 264.7 cells에서의 강력한 iNOS 효소 저해 활성을 나타내는 Zingiber zerumbet (L.) J.E. Smith (생강과) 근경의 n-hexane 분획 추출물에서 활성에 따른 분획을 실시하였다. iNOS 저해 활성 물질은 silica gel column chromatography, sephadex, TLC 등을 이용하여 분리하였고, spectroscopic data (mp, MS, ¹H-, ^(13)C-, HSQC, HMBC and COSY NMR)와 문헌 조사를 통해 분리된 물질의 구조를 분석, 결정하였다. 그 결과, 이 식물의 주요 활성 물질인 zerumbone (1, 2E,6E,9E-humulatrien-8-one)이 분리되었다. Zerumbone의 IC_(50) 값은 5.4 μM로, 이는 positive control인 N^(ω)-monomethyl-_(L)-arginine (_(L)-NMMA, IC_(50) = 21.3 μM)보다 더 강력한 저해 활성을 보이는 것으로 나타났다. 추가적으로 분리된 네 개의 kaempferol 유도체들 중에서 isokaempferide (4, kaempferol-3-O-methylether)와 kaempferol-3,4'-O-dimethylether (5)은 약한 iNOS 효소 저해 활성을 보인 반면 (각 IC_(50) = 41.6, 42.0 μM), kaempferol 3,4',7-trimethyl ether (6)와 4''-O-acetylafzelin [7, kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside)] 은 20 μg/mL 이상의 IC50 값을 보여 활성이 없는 것으로 판단되었다. 또, 두 개의 방향족 물질인 p-hydroxybenzaldehyde (2)와 vanillin (3)도 유효한 활성을 나타내지 않았다. (2), (3)번과 (6)번은 알려진 물질이지만, 이 식물에서는 처음 발견되었다.;Activity-guided fractionation of the n-hexane-soluble fraction of the MeOH extract of Z. zerumbet using a bioassay based on the inhibition of lipopolysaccharide (LPS)-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) in murine macrophage RAW 264.7 led to the isolation and identification of a sesquiterpene, zerumbone (1), aromatic compounds, p-hydroxybenzaldehyde (2) and vanillin (3), and four kaempferol derivatives, isokaempferide (4, kaempferol-3-O-methylether), kaempferol-3,4'-O-dimethylether (5), kaempferol 3,4',7-trimethyl ether (6), and 4''-O-acetylafzelin [7, kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside)]. All of the seven compounds are well-known in Zingiber species, but 2, 3, 6 have not previously been described in this plant. Zerumbone (1) exhibited a significant inhibitory activity on lipopolysaccharides (LPS)-induced iNOS in murine macrophage RAW 264.7 cells with an IC_(50) value of 5.4 μM which is more potent than the known selective inhibitor of iNOS, N^(ω)-monomethyl-L-arginine (L-NMMA, IC_(50) = 21.3 μM). In addition, compounds 4 and 5 were showed moderate activities with IC_(50) values of 41.6 and 42.0 μM, respectively. However, compounds 2, 3, 6, and 7 were inactive in this assay system. The structures of 1-7 were determined by analysis of physical and spectroscopic data (mp, UV, IR, MS, ¹H-, ^(13)C-, HSQC, HMBC and COSY NMR) as well as by comparison with published values. Isolation, structural identification and the biological evaluation of the compounds are described herein.