Inhibitory effects of a phenylbutenoid dimer isolated from Zingiber cassumunar and indirubin-5-nitro-3'-monoximeon the growth of human lung cancer cells

Abstract

암은 현대인의 건강을 위협하는 최대의 질병으로서, 암을 정복하려는 인류의 노력에도 불구하고 암으로 인한 사망률은 지속적으로 증가하고 있다. 우리나라의 경우 2003년 한해동안 암으로 인한 사망자의 수는 전체 사망자 수의 약 26%로 사망원인 순위 1위이며, 폐암은 2000년 이후 암 사망률 1위로 계속 그 수가 증가하고 있으며 위암, 간암, 췌장암 등이 그 뒤를 잇고 있는 것으로 나타났다. 환경오염 및 스트레스의 증가로 인해 암 사망률은 전혀 개선되고 있지 않은 실정이며, 이에 이미 발생한 암의 치료보다는 암이 생성되기 이전에 암을 예방하려는 화학적 암예방이 경제적이고 효율적인 접근 방법으로 인식되고 있다. 화학적 암예방 물질은 채소, 과일, 생약 및 생약 추출물 등의 인간의 식이에서 많이 발견되고 있으며, 이러한 천연물을 이용한 화학적 암예방의 중요성이 증가하고 있다. 본 연구에서는 Zinigber cassumunar Roxb.에서 분리한 (±)-trans-3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3''',4'''-dimethoxystyryl]cyclohexene (compound 1)의 사람 폐암 세포주에 대한 항암 활성과 대표적인 CDK 저해제 indirubin의 유도체인 indirubin-5-nitro-3'-monoxime의 사람 폐암 세포주에 대한 항암 활성을 연구하여 화학적 암예방 물질의 개발에 가능성을 제시하고자 하였다. (±)-trans-3-(3´,4´-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3''',4'''-dimethoxystyryl] cyclohexene (compound 1)은 Zinigber cassumunar Roxb. (생강과)에서 분리한 물질로서 여러 사람 암세포에서 암세포 성장 억제를 보였다 (IC_(50) = 11.51 μM, A549 사람 폐암 세포주; IC_(50) = 11.64 μM, SNU-638 사람 위암 세포주; IC_(50) = 15.51 μM, Col2 사람 결장암 세포주; IC_(50) = 16.03 μM, HT1080 사람 섬유육종 세포주). 암세포 성장 억제 효과가 사람 폐암 세포주에서 가장 강하게 나타났고, 또한 폐암 발생률이 다른 암에 비하여 높다는 것에 근거하여 Compound 1의 암세포 성장 저해 작용기전은 사람 폐암 세포주인 A549를 가지고 연구하였다. Compound 1은 A549 세포에서 시간 및 농도 의존적인 세포 성장 억제를 보였고, FACS analysis 방법을 이용하여 compound 1에 의한 A549 세포의 세포 주기를 분석한 결과 compound 1이 G1 phase cell cycle arrest를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. Compound 1은 p53 단백질 발현을 억제시키고 p21 단백질 발현을 유도시킴으로써 G1 phase cell cycle arrest를 일으키는 것으로 확인되었다. 또한 세포 주기를 조절하는 인자인 CDK4, cyclin D1, CDK2, cyclin A, PCNA의 단백질 발현을 강하게 억제하여 세포 주기의 진행을 억제시킨다는 사실도 확인되었다. 따라서 compound 1은 p53 비의존적인 p21 발현을 유도하고 여러 세포 주기 조절 인자의 발현을 억제시킴으로써 G1 phase cell cycle arrest를 일으켜 A549 사람 폐암 세포주의 성장을 억제시킨다는 사실을 알 수 있다. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime은 CDK (cyclin-dependent kinase) 저해제로 알려져 있는 indirubin의 유도체로 합성된 물질이다. CDK는 세포 주기를 조절하는 단백질로서 세포 사멸, DNA 전사, 세포 분화 등을 조절하는 중요한 인자이므로 암 세포의 성장을 저해하는 데에 있어서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다고 할 수 있다. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime은 여러 사람 암세포에서 강한 암세포 성장 저해 활성을 나타냈다 (IC_(50) = 5.43 μM, A549 사람 폐암 세포주; IC_(50) = 25.49 μM, Col2 사람 결장암 세포주; IC_(50) = 5.87 μM, HT1080 사람 섬유육종 세포주; IC_(50) = 9.23 μM, HL-60 사람 혈액암 세포주). Indirubin-5-nitro-3'-monoxime의 암세포 성장 억제 효과가 사람 폐암 세포주에서 가장 강하게 나타났고, 또한 폐암 발생률이 다른 암에 비하여 높다는 사실에 근거하여 암세포 성장 저해 및 세포사멸 작용기전을 A549 사람 페암 세포주에 대하여 연구하였다. Indirubin-5-nitro-'´-monoxime에 의한 세포 주기를 분석했을 때, indirubin-5-nitro-3´-monoxime은 약한 G2 phase cell cycle arrest와 세포사멸을 유도한다는 것을 확인했다. 핵을 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 세포사멸의 형태학적 특징인 nuclear chromatin condensation을 관찰할 수 있었고 세포사멸의 대표적인 생물학적 특징인 DNA fragmentation을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 indirubin-5-nitro-3'-monoxime은 tumor suppressor인 p53과 CDK 저해물질인 p21의 발현을 증가시켰고, mitochondria로부터 분비되는 cytochrome c의 분비를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 indirubin-5-nitro-3'-monoxime은 p53 의존적 p21 발현을 증가시켜 G2 phase cell cycle arrest 및 세포사멸을 유도시키고 mitochondria를 경유한 세포사멸을 유도한다고 볼 수 있다. 이상에서 Zinigber cassumunar Roxb.에서 분리한 (±)-trans-3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3''',4'''-dimethoxystyryl]cyclohexene (compound 1)과 indirubin-5-nitro-3'-monoxime은 암세포 성장 저해 물질로서의 가능성이 제시된다.;(±)-trans-3-(3',4'-Dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3''',4'''-dimethoxystyryl]cyclohexene, a phenylbutenoid dimer isolated from Zingiber cassumunar Roxb. (Zingiberaceae) inhibited human cancer cell growth in vitro. The compound showed a potent inhibition effect of cell growth in cultured human cancer cell lines (IC50 = 11.51 μM for A549, human lung cancer cell; IC50 = 11.64 μM for SNU-638, human stomach cancer cell; IC50 = 15.51 μM for Col2, human colon cancer cell; IC50 = 16.03 μM for HT1080, human fibrosarcoma cell). Prompted by the potent growth inhibitory effect, additional mechanism of action studies were performed with cultured A549 human lung cancer cells. Using flow cytometric analysis, it showed G1 phase cell cycle arrest in a concentration- and time-dependent manner. Treatment of the compound elevated the expression levels of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor p21, and decreased the expression levels of p53 and cell cycle regulating protein CDK4, cyclin D1, CDK2, cyclin A, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). These results indicate that the inhibitory effect of cancer cell growth by the compound was related to the induction of the cell cycle arrest by p53-independent p21 induction and inhibiting cell cycle regulating proteins, against human lung cancer cells. Cyclin-dependent kinases (CDKs) regulate the cell division cycle, apoptosis, transcription, and differentiation. Inhibition of CDKs is a theme of major interest in current anticancer agent research. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime, a derivative of CDK inhibitor indirubin, is a synthetic compound that inhibits tumor growth in vitro. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime showed a potent growth inhibition in human cancer cell lines (IC50 = 5.43 μM for A549, human lung cancer cells; IC50 = 25.49 μM for Col2, human colon cancer cells; IC50 = 5.87 μM for HT1080, human fibrosarcoma cells; IC50 = 9.23 μM for HL-60, human myeloid leukemia cells). Prompted by the potent growth inhibition, additional studies on mechanism of action were performed with cultured A549 of human lung cancer cells. Using flow cytometric analysis, indirubin-5-nitro-3'-monoxime showed weak G2/M phase cell cycle arrest and apoptosis in a concentration-dependent manner. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime showed apoptotic morphological features in microscopic observation. DNA fragmentation, an evidence of apoptosis, was also revealed by agarose gel electrophoresis. In addition, the expression level of tumor suppressor p53, CDK inhibitor p21, and release of cytochrome c were increased. These results indicate that indirubin-5-nitro-3'-monoxime induces the cell cycle arrest and apoptosis mediated by induction of p21 protein on a p53-dependent event and also via mitochondria mediated pathway. Indirubin-5-nitro-3'-monoxime might be a potential candidate for development of anticancer agent.