CYP3A4 유전자 발현 조절 및 Histone deacetylase inhibitor의 작용기전 연구

Abstract

Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)는 사람 간에서 가장 많이 존재하는 약물 대사 효소로서 간 내 CYP450 총량의 약 30%를 차지하며 현재 시판되고 있는 약물 중 약 60% 이상의 대사에 관여한다. CYP3A4 유전자 발현은 다양한 구조의 유도제들에 의해 유도되는데 이러한 과정에 steroid and xenobiotic receptor (SXR) 시스템이 관여하는 것으로 알려져 있다. CYP3A4 유전자 상의 cis-element인 ER-6 나 DR-3 만으로도 유도반응이 야기될 수 있으나 xenobiotic response enhancer module (XREM, -7208 ~ -7836 bp)이 존재하는 경우 반응이 더 높아진다. 본 논문에서는 CYP3A4 유전자 발현 기전을 알아보기 위해 cis-elements를 포함하는 proximal promoter region과 XREM을 모두 가지는 chimeric CYP3A4 luciferase reporter gene인 phCYP3A4-XREM-Luc을 이용하였다. 일차적으로 CYP3A4 유도제에 의한 반응을 살펴보았으며, CYP3A4와 여러 다양한 핵 내 수용체인 SXR, HNFs 및 ER의 상관성에 관한 실험을 하였다. 유도제에 의한 CYP3A4 유전자 발현에 있어서 chromatin structure remodeling의 영향을 알아보기 위하여 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제와 CYP3A4 유도제를 병용 처치하여 활성을 측정하였다. HepG2 세포에서 CYP3A4 유도제 및 17β-estradiol 에 의한 CYP3A4-XREM 활성은 SXR의 cotransfection에 의해 더 증가하였다. SXR에 의한 활성 증가 정도는 전반적으로 SXR의 농도 증가에 따라 커지다가 완만히 포화되는 양상으로 1대 1의 비율일 때 가장 높게 나타났다. 또한 ERα의 과발현 시에 증가했던 CYP3A4-XREM 활성은 SXR에 의해 경쟁적으로 감소하는 경향을 나타내었다. HNF의 영향은 각 subtype별로 차이를 보이는데, 그 중 HNF4α의 경우에는 CYP3A4 유도제에 의한 활성을 약간 증가시키는 경향이 나타났다. 반면 SXR 과발현에 의해 증가했던 기저 promoter activity는 HNF4α에 의해 현저하게 감소하여 CYP3A4 유전자 발현 조절에 있어 HNF4α와 SXR이 경쟁관계에 있음을 시사한다. 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제, IN 2001과 CYP3A4 유도제의 병용 처치에 의해 CYP3A4-XREM 활성은 증가하였고 SXR, HNFs같은 nuclear receptor 도입 시에도 약간 증가하는 양상을 보였다. 한편, antiestrogen 내성 유방암과 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor : ER) 음성 유방암의 치료 및 예방을 위한 신규 항암 후보물질로서의 HDAC 저해제, IN 2001의 작용 기전을 살펴보기 위해서 발암 생쥐 모델에서 HDAC 저해제에 의한 단백질 변화를 western blot analysis를 통해 측정하였다. 발암 동물모델로서 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 MMTV/c-Neu/CYP1B1/TAK 형질 전환 생쥐를 이용하여 in vivo 조직에서의 단백질 발현을 검색한 결과 암조직 및 자궁조직에서 IN 2001 투여에 의해서 에스트로겐 수용체 발현이 증가하였고, p21CIP1/WAF1 발현 또한 시간 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 연구 결과들에서 CYP3A4 유전자 발현 조절에 있어 SXR의 필요성 및 hERα, HNF4α 등과 같은 다른 nuclear receptor들의 개입 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 히스톤의 아세틸화 정도에 따른 HDAC 저해제의 chromatin structure remodeling이 CYP3A4 유전자 발현 활성화에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 신규 항암 후보 물질로서의 HDAC 저해제, IN 2001은 발암 동물 모델에서 에스트로겐 수용체, p21 등의 특정 단백질 발현 증가를 유도하여 호르몬 치료에 따른 항암 작용을 돕거나 세포주기 정지 및 세포사멸 유도 작용을 매개로 유방암 억제작용을 나타낼 것으로 사료된다. 앞으로 이들의 작용기전에 관한 더 많은 연구가 필요할 것이다.;Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) is the most abundant CYPs in human liver, comprising approximately 30% of the total liver CYPs contents and involved in the metabolism of more than 60% of currently used therapeutic drugs. The expression of CYP3A4 gene is induced by a variety of structurally unrelated xenobiotics including the antibiotic rifampicin, pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN), and endogenous hormones that might be mediate through multiple nuclear transcription factors such as steroid receptors, xenobiotic receptor, SXR, and HNFs. Proximal promoter region containing ER-6 and DR-3 of CYP3A4 gene showed more strong promoter activity with existence of XREM (xenobiotic response enhancer module, -7208 ~-7836 bp) that without XREM. In order to gain the insight of the molecular mechanism of CYP3A4 gene expression, the effect of SXR and HNF and estrogen receptor (ER) were investigated to see if they were involved in the regulation of CYP3A4-XREM activity. Also we investigated the effect of histone deacetylation on the regulation of CYP3A4 gene expression using phCYP3A4-XREM-luc in bioassay system. HepG2 cells were transfected with phCYP3A4-XREM-luc and treated with CYP3A4 inducers such as rifampicin, dexamethasone, PCN, RU-486 and estradiol, in order to examine the regulation of CYP3A4 gene expression in the presence or absence of SXR. CYP3A4-XREM activity was increased when SXR or hERα was cotransfected. And we showed that hepatocyte nuclear factor (HNF4a) was critical in the transcriptional activation of CYP3A4-XREM activity. The data suggest that these nuclear receptors interact competitively. HNF1α and HNF3α did not increase of CYP3A4 gene expression that was inducer. A new class of histone deacetylase (HDAC) inhibitors, IN 2001 increased CYP3A4-XREM promoter activity over untreated control cells and rifampicin concomitant treatment with IN 2001 increased further activity that was stimulated by IN 2001. This data suggested that HDAC inhibitors seemed to facilitate the CYP3A4-XREM-promoter to be activated by chemicals. Meanwhile, estrogen receptor (ER) expression status serve as a indicator of responsiveness to cancer therapy for antiestrogen resistant breast cancer and estrogen receptor negative breast cancer. One potential mechanism leading to loss of ER is reversible epigenetic modifications including histone deacethylation and DNA methylation. As a consequence, our studies focused on ER expression change by HDAC inhibitor, IN 2001 as a newly developmented anticancer agent. In MMTV/c-Neu transgenic mice and MMTV/c-Neu/CYP1B1/TAK triple transgenic mice we investigated the effect of IN 2001 on the expression of estrogen receptor gene. 30 ㎎/㎏ IN 2001 treatment showed increase in gene expression of estrogen receptor in a time-dependent manner based on our western blot analysis. Also 30 ㎎/㎏ IN 2001 treatment showed increase in gene expression of p21 in a time-dependent manner. Taken together, these result suggested that SXR play critical roles in CYP3A4-XREM activation. Futher a trans activation by SXR may affect other nuclear receptors, ERα and HNF4α. And HDAC inhibitor induced chromatin structure remodeling increase in CYP3A4-XREM activity when rifampicin, dexamethasone, PCN, RU-38486 and estradiol were treated. Also, HDAC inhibitor, IN 2001 have potentiality as a good anticancer effect inducing ERa, p21 protein level change. It appears to be required further research about the underlying molecular mechanisms of these results.