Retinoids에 의한 Cyp1a1 유전자 발현 조절 기전 연구

Abstract

In mammalian, cytochrome P4501A1 (CYP1A1) is very important for metabolism of xenobiotics such as PAHs (Polycyclic aromatic hydrocarbon) and heterocyclic amine, and it is induced by environmental contaminants such as PAHs, TCDD (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin) and 3-MC (3-methylcholanthrene). In fish, like mammalian, when it is exposed to environmental contaminants, they cause specific and sensitive induction of CYP1A. Therefore, induction of CYP1A in fish and mammalian is widely used as a biomarker for exposure of environmental contaminants. In this study, to compare the function of Cyp1a1 in fish with it in mammalian, we have used rainbow trout (Oncorhynchys mykiss) hepatoma cells (RTH-149) and mouse hepatocyte (Hepa-I). We have used the United State of America EPA selected 13 different PAHs. In order to examine induction of Cyp1a1 by TCDD and PAHs, we have used the bioassay system. We examined effects of TCDD and PAHs on the Cyp1a1-luciferase reporter gene activity, 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity and Cyp1a1 mRNA level. benz(a)anthracene, benzo(b)fluoroanthene, benzo(k)fluoroanthene, chrysene and dibenzo(a,h)anthracene showed strong response to Cyp1a1 promoter activity stimulation, EROD induction and Cyp1a1 mRNA increase in both RTH-149 and Hepa-I cells. In both cells, benz(a)anthracene, benzo(k)fluoroanthene, chrysene and dibenzo(a,h)anthracene increased Cyp1a1 promoter activity and Cyp1a1 mRNA level in a concentration-dependant manner. EROD activity increased in a concentration-dependant manner but decreased in high concentration, showed bell shape. Cyp1a1 is regulated by nuclear receptors such as glucocorticoid receptor, estrogen receptor and retinoid receptor. In order to examine regulation of Cyp1a1 by retinoids, after we treated with TCDD/PAHs and all trans retinoic acid/9-cis retinoic acid, examined the Cyp1a1-luciferase reporter gene activity, EROD activity and Cyp1a1 mRNA level. In RTH-149 cells, treatment of all trans retinoic acid or 9-cis retinoic acid decreased TCDD -induced Cyp1a1 promoter activity, EROD activity and Cyp1a1 mRNA level. Treatment of all trans retinoic acid or 9-cis retinoic acid also decreased benzo(k)fluoroanthene-induced Cyp1a1 promoter activity, EROD activity and Cyp1a1 mRNA level. Treatment of all trans retinoic acid also decreased dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 promoter activity, EROD activity and Cyp1a1 mRNA level. Treatment of 9-cis retinoic acid decreased dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 mRNA level, but treatment of 1 μM 9-cis retinoic acid increased dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 promoter activity and EROD activity, however treatment of other concentration decreased. In Hepa-I cells, treatment of all trans retinoic acid or 9-cis retinoic acid increased TCDD-induced Cyp1a1 promoter activity. However EROD activity and Cyp1a1 mRNA level were decreased. Treatment of all trans retinoic acid or 9-cis retinoic acid also increased benzo(k)fluoroanthene-induced Cyp1a1 promoter activity, but EROD activity and Cyp1a1 mRNA level were decreased. Treatment of all trans retinoic acid also increased dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 promoter activity, but EROD activity and Cyp1a1 mRNA level were decreased. Treatment of 9-cis retinoic acid decreased dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 EROD activity and mRNA level, but dibenzo(a,h)anthracene-induced Cyp1a1 promoter activity was not affected significantly or decreased slightly. We have examined how RXR regulated Cyp1a1 using luciferase reporter gene assay system. We did transient cotransfection with pmCyp1a1-Luc and pECE-RXRα, and treated with TCDD/PAHs and all trans retinoic acid/9-cis retinoic acid. In RTH-149 cells, transfection with 5 and 10 ng pECE-RXRα increased Cyp1a1 promoter activity, but transfection with other amounts decreased. Cyp1a1 mRNA level showed similar results. Treatment of TCDD and all trans retinoic acid/9-cis retinoic acid showed different results in low concentration of retinoids. Treatment of benzo(k)fluoroanthene/dibenzo(a,h)anthracene and all trans retinoic acid/9-cis retinoic acid also showed different results in low concentrations retinoids. In Hepa-I cells, transfection with pECE-RXRα decreased Cyp1a1 promoter activity. Treatment of TCDD and all trans retinoic acid showed similar results, but treatment of TCDD and 9-cis retinoic acid showed different results in low concentration of retinoids. Treatment of benzo(k)fluoroanthene/dibenzo(a,h)anthracene and all trans retinoic acid/9-cis retinoic acid also showed different results in low concentration of retinoids.; 포유류에서 cytochrome P4501A1 (CYP1A1)은 다환상 방향족 탄화수소류 (Polycyclic aromatic hydrocarbons : PAHs)와 heterocyclic amine과 같은 외인성 물질의 대사에 중요한 역할을 하며, PAHs, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) 또는 3-methylcholanthrene (3-MC) 등과 같은 환경오염물질에 의해 발현이 증가한다. 포유류와 마찬가지로 어류에서도 위와 같은 환경오염물질에 의해 민감하고 특이적으로 CYP1A이 유도 된다. 따라서 CYP1A 유도 작용은 포유류뿐만 아니라 어류와 어류세포 체계에서도 오염물질에 대한 노출의 biomarker로 사용되고 있다. 본 논문에서는 rainbow trout (Oncorhynchys mykiss) hepatoma 세포인 RTH-149 세포와 mouse hepatocyte인 Hepa-Ⅰ 세포를 이용하여 어류와 포유류에서 Cyp1a1의 발현 조절 기전을 비교 연구하였다. TCDD와 13 종의 PAHs의 Cyp1a1 유도 능력을 살펴보기 위하여 생물학적 정량(bioassay) 방법을 이용하여, 다환성 탄화수소 수용체 (aryl hydrocarbon receptor : AhR)를 매개로 한 유전자 활성을 측정하였다. RTH-149 세포와 Hepa-I 세포에 각각 pmCyp1a1-Luc을 transfection 한 후 TCDD 또는 PAHs를 처치하여, 이들에 의한 Cyp1a1 유전자 발현 정도를 측정하였고, TCDD와 PAHs에 의해 유도된 Cyp1a1 효소활성 측정을 위해 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) 활성을 측정하였다. 그리고 역전사연쇄증폭반응(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction : RT-PCR)을 통해 Cyp1a1 mRNA level 변화도 측정 하였다. RTH-149 세포와 Hepa-I 세포 모두에서 benz(a)anthracene, benzo(k)fluoroanthene, chrysene, dibenzo(a,h)anthracene은 Cyp1a1 유전자 발현 및 mRNA 발현을 농도 의존적으로 증가 시켰으나, EROD 활성은 농도 의존적으로 증가하다가 고농도에서는 다시 감소하는 bell shape을 나타내었다. CYP1A1은 glucocorticoid 수용체, estrogen 수용체, retinoid 수용체와 같은 핵 내 수용체에 의한 조절을 받는다. 본 논문에서는 retinoids에 의한 Cyp1a1 유전자 조절작용을 살펴보기 위해 RTH-149 세포와 Hepa-I 세포에 all trans retinoic acid와 9-cis retinoic acid를 TCDD 또는 PAHs와 병용 처치한 후 위와 같은 방법으로 Cyp1a1 유전자 발현, Cyp1a1 효소 활성, Cyp1a1 mRNA level 변화를 측정 하였다. RTH-149 세포에서 all trans retinoic acid 와 9-cis retinoic acid는 TCDD에 의해 유도된 Cyp1a1 유전자 발현, EROD 활성, mRNA 발현을 저해 하였다. Benzo(k)fluoroanthene과 all trans retinoic acid 혹은 9-cis retinoic acid를 함께 처치하였을 때, 역시 Cyp1a1 유전자 발현, EROD 활성, mRNA 발현이 모두 저해되었다. dibenzo(a,h)anthracene과 all trans retinoic acid 혹은 9-cis retinoic acid를 함께 처치하였을 때, all trans retinoic acid는 TCDD 혹은 benzo(k)fluoroanthene과 동시 처치 시와 마찬가지로 Cyp1a1 유전자 발현, EROD 활성, mRNA 발현이 모두 저해되었다. 9-cis retinoic acid는 mRNA 발현은 저해하였으나, Cyp1a1 유전자 발현과 EROD 활성은 1 μM 9-cis retinoic acid 처치 시 오히려 증가 시켰고, 나머지 농도에서는 저해하였다. Hepa-I 세포에 TCDD와 all trans retinoic acid 혹은 9-cis retinoic acid를 함께 처치하였을 때, RTH-149 세포와 달리 TCDD에 의해 유도된 Cyp1a1 유전자 발현을 증가 시켰다. 이에 반해 EROD 활성 및 mRNA 발현은 RTH-149 세포에서와 마찬가지로 저해되었다. Benzo(k)fluoroanthene과 all trans retinoic acid 혹은 9-cis retinoic acid를 함께 처치하였을 때, Cyp1a1 유전자 발현은 증가하였고, EROD 활성과 mRNA 발현은 저해되었다. dibenzo(a,h)anthracene과 all trans retinoic acid 혹은 9-cis retinoic acid를 함께 처치하였을 때에는, TCDD 혹은 benzo(k)fluoroanthene의 경우와 마찬가지로 all trans retinoic acid는 dibenzo(a,h)anthracene에 의해 유도된 Cyp1a1 유전자 발현은 증가시켰고, EROD 활성 및 mRNA 발현은 저해하였다. 그러나 9-cis retinoic acid는 EROD 활성과 mRNA 발현은 저해하였으나, Cyp1a1 유전자 발현은 거의 변화가 없거나 오히려 감소를 나타내었다. 또한 Cyp1a1에 대한 RXR (retinoid X receptor)의 영향을 살펴보기 위하여 RTH-149 세포와 Hepa-I 세포에 pECE-RXRα를 transfection 한 뒤, retinoids를 TCDD나 PAHs와 병용 처치한 뒤, Cyp1a1 유전자 발현, Cyp1a1 mRNA level 변화를 측정 하였다. RTH-149 세포에 5 또는 10 ng의 pECE-RXRα를 transfection 시켰을 때 Cyp1a1 유전자 발현이 증가하였고, 그 이상의 plasmid를 transfection 시켰을 때에는 발현이 감소하였다. mRNA 발현 역시 같은 결과를 보였다. pECE-RXRα를 transfection 시킨 후 TCDD와 retinoids를 병용 처치한 후 Cyp1a1 유전자 발현을 측정하였을 때, pECE-RXRα를 transfection 시키지 않았을 때와 비교하여 낮은 농도의 retinoids 처치 시 결과에 있어 차이를 보였다. Benzo(k)fluoranthene, dibenzo(a,h)anthracene 역시 낮은 농도의 retinoids 처치 시 결과에 차이를 보였다. Hepa-I 세포에 0 ～ 150 ng의 pECE-RXRα를 transfection 시켰을 때, Cyp1a1 유전자 발현이 감소하였다. pECE-RXRα를 transfection 시킨 후, TCDD와 retinoids를 병용 처치하고 Cyp1a1 유전자 발현을 측정하였을 때, pECE-RXRα를 transfection 시키지 않았을 때와 비교하여 all trans retinoic acid는 비슷한 경향을 보이나, 9-cis retinoic acid는 0.01, 0.1 μM의 낮은 농도에서 오히려 저해하는 결과를 보였다. Benzo(k)fluoranthene, dibenzo(a,h)anthracene는 0.01, 0.1 μM의 retinoids가 TCDD에 의한 Cyp1a1 유전자 발현을 저해하는 결과를 보였다.