Zerumbone 유도체의 Cyclooxygenase-2 및 Inducible Nitric Oxide Synthase에 대한 활성활성과 작용기전에 관한 연구

Abstract

암은 현대인의 사망 원인 중의 하나인 질병으로 의료 기술의 발달, 조기 진단과 치료 방법의 발달에도 불구하고 극복되지 못하며 암의 발생률과 사망률은 계속해서 증가하고 있다. 따라서 암이 생성되기 이전에 암화를 억제하는 화학적 암예방 (Cancer chemoprevention)이 경제적이고 효율적인 방법으로 대두되고 있다. 화학적 암예방이란 암의 침윤과 전이과정을 늦추거나 억제, 또는 이전의 단계로 역전시키기 위해 천연물, 합성물 등을 사용하는 것으로 정의된다. 이러한 화학적 암예방 효과가 있는 여러가지 천연물이 존재하는데, 그중에서 Zingiber zerumbet 에 존재하는 zerumbone이라는 성분은 강한 화학적 암예방 작용이 있는 것으로 밝혀져 있다. 현재 알려진 zerumbone의 생리학적인 활성은 피부암의 억제, aberrant crypt foci 형성 억제, 궤양성 대장염 유도 억제, Prostaglandin E₂ 생성 억제, inducible nitric oxide synthase 와 Cyclooxygenase-2 유도 억제, tumor necrosis factor-a 생성 억제, NF-kB 활성 억제, ERK1/2 인산화 억제, IkB 소멸 억제, 항산화 활성, Epstein Barr virus 억제, 세포사멸 유도 등이 있다 2-5) 본 연구에서는 Z. zerumbet에서 분리한 zerumbone 유도체인 5-hydroxy zerumbone과 zerumboneoxide가 zerumbone과 유사한 활성을 나타낼 것으로 기대되어 cyclooxygenase-2와 inducible nitric oxide synthase의 활성을 평가해 보았으며 그 결과, COX-2의 생성물인 PGE₂ 와 iNOS의 생성물인 nitrite의 생성을 농도 의존적으로 저해한다는 것을 알 수 있었고, 5-hydroxy zerumbone의 경우 positive control인 zerumbone보다 nitrite의 생성 저해 효과는 떨어졌지만, PGE₂의 생성 저해 효과가 더 우수하게 나타난 반면 세포독성은 낮게 나타났다. Zerumbone oxide는 nitrite와 PGE₂의 생성 저해 효과가 zerumbone보다는 약했지만 저해 활성이 우수하였고 세포독성 역시 낮았다. 다음으로, 5-hydroxy zerumbone과 zerumboneoxide의 COX-2및 iNOS에 대한 저해 작용 기전을 살펴보았다. 먼저 5-hydroxy zerumbone을 살펴보면 COX-2 assay에서 zerumbone 보다 활성이 좋으나, 단백질과 유전자 발현의 저해 작용은 zerumbone에 비해 효과가 낮게 나타났다. 또한 zerumbone에 비해 세포 독성이 낮다는 장점을 가지고 있으므로 계속해서 연구해볼 가치가 있다고 여겨진다. Zerumbone은 IkB의 degradation을 막음으로서 NF-kB를 저해한다고 알려져 있다.2-5) 그러므로 5-hydroxy zerumbone과는 어떠한 기전의 차이가 있는지 알아보기 위해 연구해 본 결과 5-hydroxy zerumbone는 IkB의 소멸을 저해하고 NF-kB를 활성화 시키는 인자인 phospho-ERK와 phospho-p38의 활성화를 저해하여 결과적으로 NF-kB의 활성을 저해하는 것으로 예상된다. Zerumboneoxide는 COX-2와 iNOS의 활성이 zerumbone이나 5-hydroxy zerumbone에 비해 떨어지지만 zerumbone에 비해 세포 독성이 적고 효과가 뛰어난 편이기 ??문에 작용 기전을 연구해 보았다. zerumboneoxide는 IkB의 소멸을 저해하고 phospho-p38을 저해하지만 phospho-ERK에 대해서는 작용하지 않는다. COX-2 및 iNOS에 대한 zerumbone의 영향을 살펴 보았는데 이는 마우스 대식세포에서 시행한 결과이므로, 실제 사람 암세포주에서도 이러한 작용들을 나타내는지 알아보기 위해, COX-2를 과발현하는 사람 대장암 세포주인 HT29에 대해서 zerumbone및 그 유도체들의 세포 성장 저해 효과를 확인하였다. 실험 결과, 농도 의존적으로 성장 저해 활성을 보였으며, COX-2의 저해와 암세포 성장과의 관계에서 zerumbone의 유도체들이 어떠한 역할을 하는지 앞으로 더 연구할 가치가 있다. 또한 iNOS의 억제와 관련된 효소인 Heme oxygenase를 얼마나 유도시키는지 단백질과 유전자 발현을 통해 실험해 보았다. 그 결과, 그 결과 zerumbone과 5-hydroxy zerumbone, zerumboneoxide 모두 HO-1을 발현 시키는 것을 확인할 수 있었다. 이로서 zerumbone이 연구되어진 것을 기초로 그 유도체인 5-hydroxy zerumbone과 zerumboneoxide의 여러가지 활성을 비교 분석해 보았다. 두 물질 모두 여러가지 실험들에서 좋은 결과가 나왔기에 앞으로 더 연구해 효과적인 항염증제 뿐 아니라 암예방제로서의 가능성이 크다고 할 수 있겠다.; The inhibitors of prostaglandin biosynthesis and nitric oxide production by corresponding inducible isozymes, cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) have been considered as potential anti-inflammatory and cancer chemopreventive agents. In continuous search for cancer chemopreventive agents from natural products or synthetic chemicals, the inhibitory potential of prostaglandin E₂ (PGE₂) and nitric oxid (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophage RAW264.7 cells have been evaluated. As a result, 5-hydroxy zerumbone and zerumbone oxide, which is Zerumbone derivative isolated from the extract of Zingziber zerumbet (Zingiberaceae), showed potential inhibitory activity of LPS-induced PGE2 and NO production in a dose-dependent manner. Zerumbone and its analogs also suppressed the LPS-induced COX-2 and iNOS protein and gene expression. To further elucidate the inhibitory mechanism of zerumbone and its analogs on COX-2 and iNOS gene expression, western method was performed to check the effect of transcription factor binding activity by zerumbone and its analogs. As a result, zerumbone and 5-hydroxy zerumbone inhibited IκB degradation in LPS-stimulated macrophage cells. Further study revealed that 5-hydroxy zerumbone inhibited phospho-ERK and phospho-p38 activity in LPS-stimulated macrophage cells. While phospho-p38 activity was inhibited by zerumbone and zerumboneoxide, phospho-ERK was not inhibited. zerumbone and its analogs also showed antioxidant activity by heme oxygenase induction. In addition, zerumbone and its analogs inhibited human colon cancer cell (HT-29) growth in a time- and dose-dependent manner. The inhibitory effects of zerumbone analogs on COX-2, iNOS, and MTT assay were evaluated. As a result, 5-hydroxy zerumbone and zerumboneoxide was found to have significant inhibitory effects on COX-2, and iNOS. These findings suggest 5-hydroxy zerumbone and zerumboneoxide might be promising candidates for developing cancer chemopreventive agents.