CYP1B1 유전자 발현 조절 작용 연구 및 CYP1B1-CALUX 시험법 확립

Abstract

Cytochrome P4501B1 (CYP1B1)은 주로 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD)과 같은 다환상 방향족 탄화수소에 의해 유도되는데 이러한 유도 작용은 여러 가지 화합물에 의해 조절을 받는다. 본 실험에서는 사람 유방암 세포주인 MCF-7에서 여러 화학 물질이 CYP1B1 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 사람의 CYP1B1의 5´ flanking DNA를 luciferase reporter 유전자를 포함한 vector에 clone하여 Hepa-I 세포와 MCF-7 세포에 transfection 한 뒤, 여러 가지 화합물을 처리하여 발현되는 luciferase 활성을 측정하였다. CYP1B1 효소는 PAHs 대사에 관여하며, estradiol을 발암성 대사체인 4-hydroxy estradiol로 전환시킨다. Luciferase 활성은 1 nM TCDD에 의해 약 20배 정도 증가하며, 이러한 반응은 농도 의존적이다. Hepa-Ⅰ 세포에서 17β-estradiol은 TCDD에 의해 유도 발현된 luciferase 활성을 감소시켰으며, 이러한 감소 효과는 ER의 부분 길항제인 tamoxifen과의 병용 처치로 부분적으로 회복되었다. 17β-estradiol 대사체인 16α-estriol도 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였다. 저산소 상태 유도 물질인 cobalt chloride (CoCl2)와 picolinic acid (PA)는 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제하였다. 히스톤의 아세틸화와 탈 아세틸화는 유전자 발현에 중요하다. Hepa-Ⅰ 세포에 phCYP1B1-Luc을 transfection한 후, 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제인 Tricostatin A, IN2001과 SAHA를 유도제와 같이 처치하였을 때, CYP1B1의 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 실험에 사용한 모든 히스톤 탈 아세틸화 효소 저해제들은 단독처치 시 대조군에 비해 luciferase 활성이 증가하였고, TCDD에 의해 유도된 CYP1B1의 유전자 활성도 증가시켰다. 산업 사회에서 사람들은 유기체의 불완전 연소로 생기는 환경 오염물질인 PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons)에 쉽게 노출이 된다. PAHs는 AhR (aryl hydrocarbon receptor)의 강력한 효능제이다. 세포에서 cytochrome P4501B1 (CYP1B1)의 유도는 AhR 활성에 대한 파라미터로 사용된다. 또한 PAHs는 cytochrome P450에 의하여 활성화된다고 알려져 있다. 본 논문에서는 사람 유방암 세포주인 MCF-7에서 13 종의 PAHs와 환경시료가 CYP1B1에 미치는 영향을 알아보았다. PAHs에 의해 유도된 CYP1B1-luciferase reporter gene 활성과 CYP1B1 mRNA의 발현을 측정하였다. Benzo(k)fluoranthene과 dibenzo(a,h)anthracene은 농도 의존적으로 CYP1B1의 유전자 발현과 mRNA의 발현을 증가시켰다. MCF-7 세포에서 acenaphthene, anthracene, benzo(b)fluoranthene, fluorene, fluoranthene, naphthalene, pyrene, phenanthrene and carbazole은 약한 반응을 보였다. RT-PCR analysis에서도 PAHs는 CYP1B1의 mRNA 발현을 크게 증가시켰다. Genistein, daidzein, chrysin, naringenin and morin과 같은 flavonoids에 대해서도 연구하였다. 이러한 flavonoids는 저농도에서는 B(k)F에 의해 유도된 luciferase 활성을 저해하지만, 고농도에서는 오히려 luciferase 활성을 증가시켰다.;Cytochrome P4501B1 (CYP1B1) is known to be inducible by xenobiotic compounds such as policyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and dioxins such as 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD). And these induction of CYP1B1 is also regulated by many categories of chemicals. In order to investigate the effects of several chemicals on CYP1B1 gene expression in Hepa-Ⅰ and MCF-7 cells, 5' flanking DNA of human CYP1B1 was cloned into pGL3 basic vector containing luciferase gene, and then transfected into these cells. After treatment of chemicals, the luciferase activity was measured. CYP1B1 enzyme metabolize PAHs and estradiol. CYP1B1 metabolize estradiol to 4-hydroxyestradiol that is considered as carcinogenic metabolite. Luciferase activity was induced about 20 folds over that control by 1 nM TCDD (2,3,7,8-tetrachloro-p- dioxin) and these inductions were dose-dependent. 17β-estradiol significantly inhibited TCDD stimulated luciferase activity dose dependently and this inhibition was partially recorvered by concomitant treatment with tamoxifen. And also, 17β-estradiol metabolite, 16α-estriol resulted in inhibitory effect on CYP1B1 gene expression. To study the effects of hypoxic condition on the TCDD induced CYP1B1 gene expression, cobalt chloride and picolinic acid were administrated before the treatment of TCDD. All these reagent decreased the luciferase activity induced by TCDD. Acetylation and deacetylation of histone are important for gene expression. We observed the effect of HDACs inhibitors on CYP1B1 gene expression in Hepa-I cells were transfected with phCYP1B1-Luc transiently. All HDAC inhibitors that used, increased CYP1B1 transcription alone and TCDD induced CYP1B1 transcription. Recent industrialized society, human has been widely been exposed to widespread environmental contaminants such as PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbon) that are originated from the incomplete combustion of hydrocarbons. PAHs are known to be ligands of the AhR (aryl hydrocarbon receptor). Induction of cytochrome P4501B1 (CYP1B1) in cell culture is widely used as a biomarker for PAHs. Therefore we have studied the effect of PAHs in the human breast cancer cells MCF-7 to evaluate bioactivity of PAHs. We have used the United State of America EPA selected 13 different PAHs, PAHs mixtures and extracts from environmental samples to evaluate the bioassay system. We examined effects of PAHs on the CYP1B1-luciferase reporter gene and CYP1B1 mRNA level. Benzo(k)fluoranthene and dibenzo(a,h)anthracene showed strong response to CYP1B1 promoter activity stimulation, and also CYP1B1 mRNAs increase in MCF-7 cells in a concentration-dependent manner. Acenaphthene, anthracene, benzo(b)fluoranthene, fluorene, fluoranthene, naphthalene, pyrene, phenanthrene and carbazole were weak responders in MCF-7 cells. RT-PCR analysis indicated that PAHs significantly up-regulate the level of CYP1B1 mRNA. Some flavonoids such as genistein, daidzein, chrysin, naringenin and morin were also investigated. These flavonoids decreased B(k)F induced luciferase activity at low concentration. But, these flavonoids exhibited stimulatory effect at high concentration.