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새롭게 합성된 화합물들의 효능분석

Title
새롭게 합성된 화합물들의 효능분석
Other Titles
Screening of biological activities for newly synthesized compounds on muscarinic receptor binding and inhibition of nitric oxide synthases
Authors
유소연
Issue Date
2002
Department/Major
대학원 약학과
Keywords
합성 화합물효능분석무스카린성수용체선택성 이형
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
신약을 개발함에 있어서 기존의 약물을 lead compound로 하여 새로운 화합물을 합성하는 방법은 매우 기본적이다. 본 논문에서는 무스카린성 효능제인 milameline을 선도 물질로 하여 합성된 화합물과 항암, 항균 등 여러 가치 생리 활성을 나타내는 quinone 유도체들의 효능을 스크리닝하였다. Part Ⅰ에서는 무스카린성 수용체의 선택성 아형에 대한 새로운 화합물의 수용체 결합 및 세포 내 기능에 대한 연구를 하였다. 본 연구에서는 한국 화학 연구소에서 합성된 화합물이 수용체에 대한 결합 활성을 갖는지 알아보기 위해 30개의 화합물들에 대해서 비선택적인 muscarinic 수용체의 길항제인 [^3H]QNB로 Hm1, Hm2, Hm3 수용체에 대한 competition assay를 수행하였다. 또한 26 개의 화합물들에 대해서 Hml 수용체에 결합함으로써 세포 내 신호 전달 체계를 흥분시킬 수 있는 지를 이차 전달 물질인 세포 내 칼슘의 변화로 조사하였다. 무스카린성 부분 효능제로 알려진 milameline의 Ki 값은 Hm1, Hm2, Hm3 에서 모두 대략 160 μM 이었고, xanomeline 은 Hm1과 Hm3에서 약 2μM, Hm2에서 10μM 으로 xanomeline이 milameline보다 Hm1과 Hm3에 약 80 배, Hm2에 약 10 배 가량 높은 친화력이 있었다. 대부분의 화합물들은 Hm1, Hm2, Hm3 수용체에 xanomeline보다 훨씬 낮은 결합 활성을 보였으며 각 수용체에 비슷한 결합 친화성이 있었다. KR-020034는 Hm1 (Ki = 721μM)과 Hm3 (Ki = 552μM)에 비교적 낮은 affinity의 binding 경향을 보였지만 Hm2에는 전혀 결합 활성이 없어 Hm1과 Hm3에 선택적으로 결합하는 화합물일 가능성이 있다. 또한 KR-984058-2는 Hm1 (Ki = 37μM)에 대한 결합 활성이 Hm2 (Ki = 164μM)와 Hm3 (Ki = 161μM)보다 약 5배 가량 높았고, KR-010054는 Hml에 대하여 binding affinity가 높진 않았지만 (Ki = 701μM) 결합하는 반면, Hm2와 Hm3에는 높은 농도에서조차 결합 활성을 거의 보이지 않아서 Hml에 선택적 affinity가 있는 화합물로 추측된다. 하지만 이들 결과는 1회 실험에서 얻었으므로 반복 실험을 통해서 확인 해보아야 하며, 화합물의 구조와 subtype에 대한 affinity의 비교 분석을 통해 선택적인 결합 활성을 갖는 화합물을 도출할 수 있을 것이다. 세포 내 기능 연구에서는 26 개의 화합물 중 9개 화합물들이 세포 내 칼슘 증가 반응을 일으켰다. 그러나 xanonieline과 milameline을 제외한 7 개의 화합물들은 mock 세포와 Hm1으로 감염된 세포에서 모두 세포 내 칼슘을 증가시켰고 무스카린성 길항제인 atropine에 의해 저해되지 않았으며 수용체에 대한 결합 활성과도 뚜렷한 상관 관계를 갖지 않아 무스카린성 수용체를 경유하지 않는 것으로 보인다. 또한 세포 내외의 칼슘 blocker의 영향을 받지 않고, 세포의 상태와 무관하여 세포를 경유하치 않은 특이한 반응으로 예상된다. 원인의 정확한 분석을 위해서는 세포 내 칼슘의 indicator로 사용된 fura-2/AM의 화학 구조와 합성 화합물들의 화학 구조를 비교 분석할 필요가 있다. 무스카린성 효능제인 oxotremorin-M, milameline, xanomeline은 Hm1과 Hm3가 발현된 세포에서 선택적으로 세포 내 칼슘을 증가시켰으며 이 같은 baculovirus/Sf9 체계에서 무스카린성 효능제에 의한 세포 내 칼슘 변화는 세포 내에서 나온 칼슘보다 외부에서 유입된 칼슘이 더 우세한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Part Ⅱ에서는 새로 합성된 quinone 유도체들의 쥐 혈관 이완 억제 효과와 쥐 뇌 NO 생성 억제 효과를 연구하였다. 본 실험에서는 혈관 이완 억제력이 있다고 알려진 quinone 유도체의 하나인 6-arylamino-5,8-quinolinedione (LY83583)을 선도물질로 하여 새로 합성된 quinone 유도체인 6-arylamino-2-(2-pyridyl)-4,7- benzimidazolediones (HPBIQs), 6-arylamino-5,8-quinazolinediones (DQZs), 6-arylamino-5,8-quinolinediones (OQ21), 7-arylamino-5,8-quinazolinediones (SKHs) 등 12 개 약물에 대하여 흰 쥐의 적출 흉곽대동맥을 이용한 organ bath 실험을 통해 내피 의존성 혈관 이완에 대한 억제 작용을 screening하였다. 또, 이 화합물들을 이용하여 흰쥐 forebrain homogenate에서 NOx 형성 억제력을 screening하였다. 6-Arylamlno-5,8-Quinazolinediones(DQZs), 6-arylamino-5,8-quinolinediones(OQ21), 7-arylamino-5,8-quinazolinediones (SKHs) 계열의 약물들에서는 혈관 이완억제력과 뇌 내 NOx 형성 억제력 사이에는 뚜렷한 상관 관계가 없었고, 6-arylamino-2-(2-pyridyl)-4,7-benzimidazolediones (HPBIQs)는 0.1 μM농도에서 혈관 이완 억제에 전혀 효과가 없었으나 10 μM 농도에서 뇌 내 NOx 형성을 강하게 억제하였고, 그 중 HPBIQ04는 0.1 μM 농도에서도 뇌내 NOx 형성을 약 20% 가량 억제하여서 이 계열 약물들이 eNOS보다 nNOS에 좀 더 선택적인 저해력을 가질 것이라고 추측된다. 또한 HPBIQ 계열 화합물 중 유의성 있게 nNOS를 강하게 저해한 HPBIQ05와 HPBIQ14는 다른 화합물들과 비교해보았을 때 화학 구조적인 특성은 없었으나 항진균 작용 역시 강하게 나타났고 nNOS에 대한 저해력이 상대적으로 낮게 나타난 화합물 중 HPBIQ01은 대부분의 균주에서 약한 항진균 작용을 보여 이들 세 화합물은 nNOS 저해능과 항진균능에서 비슷한 경향을 보였다.;The purpose of this study is screening the biological efficacy of newly synthesized compounds. In Part I of this study, newly synthesized compounds were screened as selective muscarinic receptor subtype agonists. Thirty compounds were tested their binding affinities and twenty six compounds were examined for their intracellular Ca^(2+) responses in human muscarinic receptor (Hm)-expressed S19 cells. All test compounds showed low affinity than a control lead compound xanomeline, a partial Ml and M2 agonist. KR-020034 showed higher selectivitiesfor Hml and Hm3 than for Hm2. KR-984058-2 and KR-010054 had highe affinity for Hm2 and Hm3. Among twenty six compounds tested for their intracellular Ca^(2+) responses only seven compounds (KR-010004, KR-010083, KR-020024,KR-020025, KR-020037, KR-020038, KR-020041), which had weak affinities for Hml,increased (Ca^(2+))i. Although KR-010008 and KR-020045 had higher affinities for Hml than those seven compounds, they couldn't show intracellular Ca^(2+) responses. We found that the intracellular Ca^(2+) responses induced by those compounds were not specific in muscarinic receptor Hml-expressed cells because same responses were observed in mock-cells that did not express any muscarinic receptors. Moreover, the test compounds induced Ca^(2+) responses were not blocked by rnuscarinic antagonist, atropine. These results suggegt that the Ca^(2+) responses we observed are not mediated by muscarinic receptors. The possibilities for antagonistic activity of test compounds were also excluded. Therefore, none of test compounds had activities as selective muscarinic agonists. The relationship between chemical structures of the compounds and fura-2/AM, intracellular Ca^(2+) indicator, should be investigated. In the baculovirus/Sf9 cell system, the Ca^(2+) mobilization in response to OxoM, muscarinic agonist, was diffarent from that seen in other neuronal cells that express endogenous muscarinic receptors, where very rapid and transient changes are usually observed. The response in the Sf9 cells was slow and more sustained. In Part II of this study, screening of newly synthesized quinone derivatives as nitric oxide synthase (NOS) inhibitors were performed. Twelve quinone derivatives including 6-arylamino-2-(2-pyridyI)-4,7-benzimidazolediones (HPBIQs), 6-arylamino-5,8-quinazolinediones (DQZs), 6-arylamino-5,8-quinolinediones and 7-arylamino-5,8-quinazolinediones (SKHs) were tested for their inhibitory effects on eNOS by investigating the effect on endothelium-dependent relaxation of isolated rat aorta. The inhibitory effects on nNOS by the compounds were also tested by measuring NOx (nitrate/nitrite) produced by NOS in rat forebrain homogenates. Six SKHs (SKH03, SKH05, SKH06, SKH08, SKH09 and SKH15) and four DQZs (DQZ02, DQZ04, DOZ05 and DQZ09) showed relatively strong inhibitory effects on eNOS at 0.1 μM, and also inhibited both nNOS activity effectively at 10 μM. OQ21, LY83583, SKH13 and SKH21 showed intermediate inhibition on eNOS at 0.1 μM and relatively strong inhibition on nNOS. None of relationships was detected between thechemical structures of quinine derivatives and inhibitory effects of nNOS/eNOS. None of HPBIQs showed inhibitory effects on eNOS at 0.1 μM, but most of HPBIQs strongly inhibited nNOS at 10 μM. Therefore HPBIQs inhibited nNOS than eNOS more strongly, HPBIQ05 and HPBIQ14 inhibited nNOS significantly and also showed strong antifungal activates. Further studies are required at the same concentration in order to determine the selectivity of quinone compounds tested in this study.
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