RANKL and M-CSF signaling in osteoclasts and their precursors

Abstract

파골세포는 macrophage에서 기원한 다핵세포로써 뼈를 분해시키는 유일한 세포로 알려져 있다. Macrophage와 같은 전구세포에 RANKL와 M-CSF로 자극을 주면 파골세포로의 분화가 일어난다. RANKL는 TNF superfamily에 속하는 cytokine으로써 파골세포 분화에 관여하는 가장 중요한 cytokine이다. RANKL는 전구세포로부터 파골세포로의 분화뿐만 아니라 성숙한 파골세포의 뼈 분해능을 증가시킨다. M-CSF는 파골세포 분화에 있어 중요한 인자로 밝혀졌다. M-CSF의 유일한 수용체인 c-Fms는 tyrosine kinase 활성을 가지는 수용체 중의 하나이다. M-CSF는 macrophage와 같은 파골세포의 전구세포의 증식과 생존에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 M-CSF는 파골세포의 전구세포에서 RANK의 발현을 증가시킨다. 게다가 M-CSF는 성숙한 파골세포의 생존을 연장시켜주고, 뼈 분해를 위한 cytoskeletal 변화를 조절한다. 그렇기 때문에 RANKL와 M-CSF의 역할에 관한 충분한 이해는 골다공증, 골관절염, 류마티즘, Paget병, 골수종, 전이성 골종양 등과 같은 질병 치료에 대한 새로운 전략을 제시해줄 수 있다. 첫번째 파트에서는 녹용추출물이 파골세포 분화와 성숙한 파골세포의 뼈 분해 작용에 미치는 영향을 살펴보았다. 녹용은 뼈를 튼튼하게 하고 뼈의 분해를 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 녹용의 이러한 효능에 관한 세포수준에서의 메카니즘은 거의 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서 녹용의 클로로포름 추출물 (CE-C) 이 M-CSF와 RANKL에 의한 파골세포 분화를 효과적으로 억제시킴을 밝혔다. CE-C는 파골세포의 전구세포에서 RANKL에 의한 ERK, Akt, I-kB의 활성을 억제하였다. 또한 CE-C는 성숙한 파골세포의 actin ring을 파괴하고 세포사멸을 촉진함으로써 뼈 분해능을 감소시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 녹용추출물이 골다공증과 같은 뼈분해와 관련된 질환의 효과적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 두번째 파트에서는 M-CSF에 의한 신호전달에서의 활성산소의 역할을 살펴보았다. 생리적 농도의 활성산소는 세포 이동, 분화, 증식 등과 같은 다양한 세포의 작용을 중개하지만, 과량의 활성산소는 질병을 일으키는 유독한 물질로 인식된다. 활성산소는 수용체 활성과 같은 생리적 반응에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 그렇기 때문에 M-CSF에 의해 일어나는 세포신호 전달이 활성산소에 의해서 조절될 수 있을 것이라는 가설을 세우고 실험을 진행하였다. 본 연구에서는 macrophage가 M-CSF 자극을 받으면 활성산소의 세포 내 농도가 일시적으로 증가함을 확인하였다. macrophage에 H₂O₂를 단독으로 처리해주었을 때도, c-Fms와 Gab2의 인산화 및 Akt와 MAPK의 활성화가 유도되었다. DPI를 이용하여 활성산소의 생성에 관여하는 NADPH oxidase의 활성을 억제하였더니 M-CSF에 의한 활성산소의 생성이 억제되었을 뿐만 아니라, c-Fms와 Gab2의 인산화 및 Akt의 활성화 또한 저해되었다. 또한 DPI는 macrophage의 증식을 감소시켰다. siRNA에 의해 Nox2와 Rac1의 발현양이 감소된 macrophage는 대조군에 비해 c-Fms와 Gab2의 인산화가 적게 일어남을 확인할 수 있었다. 또한 dominant-negative mutant Rac1을 발현시킨 경우에도 M-CSF에 의한 신호전달이 저해되었다. 이상의 결과를 통해, M-CSF에 의해 증가된 활성산소가 macrophage의 증식을 위한 세포 내 신호 전달을 조절하고 있음을 알 수 있다.;Osteoclasts are multinucleated cells of monocyte/macrophage origin that degrade bone matrix. The differentiation of osteoclasts is dependent on receptor activator of NF-kB ligand (RANKL), as well as macrophage-colony stimulating factor (M-CSF). RANKL is a member of the tumor necrosis factor (TNF) superfamily and is the key osteoclastogenic cytokine. RANKL stimulates both the formation of osteoclasts from their precursors and bone resorption activity of mature osteoclasts. RANKL and its receptor RANK are indispensable for osteoclastogenesis. M-CSF was first identified as an essential factor for osteoclastogenesis. c-Fms, which is a member of the receptor tyrosine kinase superfamily, is the unique receptor of M-CSF. M-CSF is crucial for the proliferation and survival of precursor cells of osteoclasts as well as macrophages. M-CSF also stimulates RANK expression in osteoclast precursors. In addition, M-CSF prolongs the survival of mature osteoclasts, and regulates the cytoskeletal changes for bone resorption. Therefore, a detailed understanding of the role of cytokines, such as RANKL and M-CSF, will lead to novel strategies for the treatment of various diseases, including osteoporosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, Paget's disease, multiple myeloma and metastatic bone tumors. In the first part, I investigated the effect of deer antler extracts on osteoclast differentiation and bone resorption. It has been reported that deer antler extract has anti-bone resorptive activity in vivo. However, little is known about the cellular and molecular mechanism of this effect. In this study, I show that chloroform extract (CE-C) of deer antler inhibited osteoclast differentiation in mouse bone marrow cultures stimulated by RANKL and M-CSF. CE-C suppressed the activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), protein kinase B (PKB/Akt) and inhibitor of kappa B (I-kB) by RANKL in osteoclast precursor cells. It also inhibited the bone resorptive activity of differentiated osteoclasts that was accompanied by disruption of actin rings and induction of apoptosis. These results demonstrate deer antler extract may be a useful remedy for the treatment of bone-resorption diseases such as osteoporosis. In the second part, I investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in M-CSF signaling. The physiological concentrations of ROS may function as a second messenger to mediate various responses, including cell migration, differentiation and growth, although excess ROS are often considered toxic products that lead to diseases. ROS may be produced by many physiological intracellular reactions in response to receptor activation. Thus, I hypothesized that M-CSF-mediated signaling cascades can be modulated by ROS. Here, I show that M-CSF stimulation of BMM cells transiently increased the intracellular level of reactive oxygen species (ROS). Exogeneous H₂O₂ induces phosphorylation of c-Fms and Gab2 and activation of Akt and MAPKs in BMM cells. Blocking the activity of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (Nox), a protein leading to the formation of ROS, with diphenylene iodonium (DPI) inhibits the response to M-CSF, including ROS production, phosphorylation of c-Fms and Gab2, activation of Akt, and proliferation of BMM cells. Reduced expression of Nox2 or Rac1 by specific siRNA blocks M-CSF-induced phosphorylation of c-Fms and Gab2. Furthermore, M-CSF-mediated signaling was suppressed by expression of a dominant-negative mutant of Rac1. Taken together, these results suggest that increased level of ROS through a signaling cascade involving Rac1 and Nox2 acts as an intracellular signal mediator for proliferation of BMM cells.