Microfluidic Devices for Immunoassay and Chemotaxis Assay

Abstract

Microfluidic systems provide a powerful platform for biological assays. Microfluidic devices were fabricated from an elastomer, polydimethylsiloxane (PDMS), using soft lithography. To build a functional microfluidic bioassay or a lab-on-a-chip, it needs to effectively include components, such as pumps, valves, reservoirs and solid materials into these platforms. In Chapter 2 and 3, we described bead-packed microfluidic immunoassay platforms for the detection of various analytes including bacterial pathogen. In Chapter 2, primary amines of antibody were covalently conjugated to carboxyl-terminated glass beads previously treated with aminosilane followed by glutaraldehyde. For application, glass beads attaching antibody specific to Escherichia coli O157:H7, a foodborn pathogen, were packed into a microfluidic device and used for detection of the serotype. This prototype immunoassay device can be used for the simultaneous detection of multiple analytes by sequentially packing different-sized glass beads attaching different antibody in discrete microchambers on a single microfluidic device. In Chapter 3, the feasibility of superporous agarose (SA) beads as a solid support for heterogeneous microfluidic immunoassays was investigated. SA beads (particle diameter 180-224 µm) containing superpores (average pore diameter 28 µm) as wells as normal diffusion pores (pore diameter 100-300 nm) were covalently conjugated to protein A. Capture antibodies immobilized beads were introduced into a microfluidic device and retained over a filter component of three rectangular pillars located inside the microchannel. Superpores of SA beads inside the microchannel allowed solution to pass through the beads, thus decreased the risk of clogging in the microchannel, and also enabled antibody to be immobilized throughout the beads, thereby improving the performance of microfluidic immunoassays. Goat IgG as analyte, alkaline phosphatase(AP)-conjugated F(ab′)2 anti-goat IgG as detection antibody, and 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP)/nitroblue tetrazolium (NBT) as substrate in a flow were subsequently introduced into SA-bead packed microfludic devices. Down to 100 pg goat IgG/mL were detected with naked eyes in the current immunoassay system. These results suggest that SA beads are highly suitable as a solid support for microfluidic immunoassays. In Chapter 4, we introduce a microfluidic device equipped with pneumatically actuated valves, generating a linear gradient of chemoattractants to quantify the chemotactic response of Tetrahymena pyriformis, a fresh water ciliate. The microfluidic device components include electronically-controlled pneumatic microvalves, microchannels, and microchambers. The linear gradient of the chemoeffectors was established by releasing a chemical from a ciliate-free microchamber into a microchamber containing the ciliate. The ciliates showed chemotactic behaviors by either swimming toward or avoiding the gradient. By counting the number of ciliates residing in each microchamber, we obtained a precise time-response curve. The ciliates in the microfluidic device were sensitive enough to be attractive to 10 pico mol glycine-proline, which indicates a 10^(5) increase in the ciliate’s known sensitivity. With the use of blockers, we have demonstrated that NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor plays a critical role in the perception of chemoeffectors, whereas the Ca^(2+) channel is related to the motility of ciliates. These results demonstrate that our microfluidic chemotaxis assay system is useful not only for the study chemotaxis of ciliates but also for a better understanding of the signal transduction mechanism on their receptors.;미세유체시스템은 생명현상의 이해와 생체물질의 분석에 있어서 효과적이고 중요한 도구로 최근 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 논문에서는 면역학적 측정법과 섬모충의 주화성 연구에 응용될 수 있는 미세유체소자를 고안하여 제시하고 있다. 이러한 바이오유체소자 (biofluidic device)들은 미세밸브, 미세채널, 소자 내에 생체 물질을 고정화 할 수 있는 입자 등을 포함한다. Chapter 2와 3에서는, 미세유체소자에 항체를 고정화 한 입자를 도입하여 병원성 미생물을 포함하는 항원을 검출할 수 있는 면역측정센서에 대해 설명하고 있다. Chapter 2에서는 aminosilane 과 glutaraldehyde를 처리한 유리입자의 카르복실 (carboxyl)기가 항체의 아민 (amine)기와 공유결합을 이루어 고정화 되는 방법을 이용하였으며 Escherichia coli O157:H7에 특이적인 항체를 고정화 하여 응용의 예를 보였다. 이 면역학적 분석 소자 는 다양한 크기의 입자들에 다른 항체를 고정화 하여 하나의 소자에 도입함으로써 여러 항원들을 동시에 검출하는 것으로의 응용도 가능하리라 예상된다. Chapter 3에서는 미세유체소자 내에 항체를 고정화 하는 새로운 지지대로써 극다공성 한천입자 (superporous agarose)를 제시하였다. 확산구멍 (100~300 nm) 뿐만 아니라 흐름구멍 (10-80 μm)을 갖는 극다공성 한천입자 (180~224 μm) 표면에 항체를 고정화 하여 미세유체 소자 내에 도입하였다. 이 때 직사각형 기둥을 소자 내에 세워 입자가 빠져나가지 못하고 채널 내에 머무르도록 하였다. 미세유체 소자 내 극다공성 한천입자의 흐름구멍은 유체가 입자를 통과할 수 있도록 하며 이는 채널 내에서 유체의 흐름을 더 원활하게 하고 항체를 입자 내부에도 고정 가능하게 함으로써 면역학적 검출 효율을 높일 수 있다. 표적물질인 goat IgG, 검출항체로 사용된 효소 (alkaline phosphatase) 가 결합한 F(ab′)2 anti-goat IgG, 기질로써 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP)/nitroblue tetrazolium (NBT) 을 극다공성 한천입자가 도입된 미세유체소자 내에 차례로 흘려주어 결과를 확인하였다. 이 시스템에서는 육안으로 100 pg/ml 농도의 표적물질까지 검출이 가능하며 이 결과는 극다공성 한천입자가 면역분석 시스템의 지지대로 사용되기에 적합하다는 점을 설명할 수 있다. Chapter 4에서는 공기압으로 가동되는 밸브를 도입하여 섬모충의 주화성 유인물질이 일정한 농도기울기를 이루고 이 때 섬모충 (Tetrahymena pyriformis)의 주화성 반응을 정량적으로 분석하는 미세유체소자를 제시하고 있다. 이 미세유체소자는 전기적으로 작동하는 공기압 미세밸브와 미세채널, 미세챔버 등을 포함한다. 주화성 유인제로 채워져 있는 챔버에서 섬모충을 포함하고 있는 챔버로 주화성 유인제가 확산됨으로써 이 물질의 일정한 농도 기울기가 형성되게 된다. 섬모충은 특정 분자의 농도 기울기를 따라 높은 농도 쪽으로 혹은 반대방향으로 운동하는 민감한 반응을 보이는데 각각의 미세챔버 내에 존재하는 섬모충의 수로 시간에 따른 운동성의 결과를 얻을 수 있었다. 미세유체소자 내의 섬모충은 10 pM 의 glycine-proline 에도 반응을 보였으며 이는 이미 보고된 섬모충의 민감성보다 105 배가 증가한 결과이다. 차단제를 이용한 실험을 통하여 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 수용체는 주화성 물질을 인지하는데 중요한 역할을 하는 반면 칼슘채널 (Ca+ channel)은 섬모충의 운동성에 관여할 것이라는 가능성을 예측할 수 있었다. 이러한 결과들로 미루어 보아 논문에서 제시되고 있는 미세유체 주화성 분석 시스템은 섬모충의 주화성 연구뿐 아니라 수용체의 신호전달 메커니즘을 이해하는 데에도 효과적인 분석도구가 될 것으로 전망된다.