다중 벡터 시스템을 이용한 Tylosin 유도체의 이종숙주 생산성 향상

Abstract

The tylosin polyketide synthase (PKS) tylGI-V genes were cloned into two compatible replicating vectors each under the control of pikAI promoter. These two replicating plasmids, pBB155 containing tylGI-III and pDHS3003 containing tylGVI-V were individually introduced into an engineered strain of Streptomyces venezuelae bearing a deletion of pikromycin PKS gene cluster (DHS2001). The resulting mutant strain (YJ005) successfully produced the 16-membered ring macrolactone (tylactone) and its glycosylated form (desosaminyl tylactone). We also cloned the last two Tyl PKS genes, tylGIV-V into an integrating vector to generate pYJ229 and transformed it and pBB155 into DHS2001. The mutant strain (YJ058) produced tylactone and its derivative 10-fold less than YJ005, demonstrating that the use of a replicating plasmid for expression of tylGVI-V are more suitable than that of an integrating plasmid. To improve the production level of tylactone and its derivative, global regulatory genes (afsR2), a gene encoding crotonyl-CoA reductase (ccr) involved in the biosynthesis of tylosin precursor, ethylmalonyl-CoA, and the tylosin type II thioesterase (TEII) named tylO were cloned into an integrating vector pSET152 and transformed into YJ005. Introduction of afsR2, ccr and tylO genes led to no observable effect on the productivity of tylactone. However, the mutant strain transformed by endogeneous pathway specific regulatory gene, pikD produced 3.4-fold enhanced tylactone and 18-fold improved desosaminyl-tylactone, demonstrating the regulatory protein PikD triggered the enhanced expression of Tyl PKS as well as desosamine (des) biosynthetic gene cluster to promote the productivity of tylactone and its glycosylated form.;본 논문은 방선균 Streptomyces venezuelae를 이종숙주로 하여, 광범위한 동물의 호흡기 질병의 예방과 치료에 사용되고 있는 폴리케타이드(polyketide)계열 항생제인 tylosin유도체의 생산성을 향상 시키기 위한 다양한 분자유전학 적인 방법에 관한 연구 결과이다. 본 연구의 목적은 폴리케타이드의 고생산 관련 유전자로 알려진 유전자의 도입을 통해 이종숙주에서 tylosin유도체의 생산성을 증대시키는 것이다. 본 연구에서 이종숙주로 사용된 균주인 S. venezuelae는 다른 방선균들과 비교하여 성장 속도가 2배 이상 빠르며 transformation 등의 유전자 조작이 매우 용이하고 gene disruption이나 deletion에 필요한 chromosome 상의 homologous recombination에 의한 double crossover가 용이한 장점이 있으므로 발현용 또는 조합 생합성의 이종 숙주로서 개발할 가치가 매우 높은 균주이다. S. venezuelae의 pikromycin (pik) polyketide synthase (PKS)제거 균주인 DHS2001에 두 종류의 SCP2*를 기반으로 한 low-copy replicating plasmid를 이용하여 tylosin PKS (Tyl PKS)의 발현 결과 tylosin전구체인 tylactone (tylosin aglycone)과 소량의 desosaminyl tylactone이 생산됨을 확인 하였다. 이 결과를 토대로 polyketide의 aglycone의 생합성 과정에 작용하여 생산량 증대를 기대할 수 있는 유전자 2가지와 polyketide 항생제 생산의 조절유전자 2가지를 선별하여 tylosin유도체의 이종생산 균주에 도입하여 각 유전자의 발현이 tylactone 및 tylosin유도체의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구에서 aglycone생성과 관련된 유전자로서 tylosin을 생산하는 야생균주인 Streptomyces fradiae에서 두 유전자, crotonyl-CoA reductase의 유전자 (ccr)와 type II thioseterase 유전자 (tylO)를 선별하였다. CCR은 tylosin의 유도체인 aglycone생성의 전구체인 ethylmalonyl-CoA의 생합성의 효소로 알려져 있다. 그리고 TylO는 tylosin의 생합성 시에 잘못된 중간체, extender unit이나 starter unit에 사용되는 acyl-CoA substrates의 non-specific loading을 hydrolysis하는 editing작용을 한다고 알려져 있다. 조절 유전자로 선별된 afsR2는 Streptomyces lividans에서 항생제 생산을 크게 증가시키는 global regulatory 유전자이며, pikD는 S. venezuelae 내에서의 Pik PKS의 발현에 activator로 작용하는 pathway-specific 조절 유전자이다. 이들 유전자의 도입결과 tylO와 afsR2는 S. venezuelae내에서의 Tyl PKS발현에 효과를 나타내지 못했다. Crotonyl-CoA reductase의 유전자 (ccr)로 형질 전환된 균주의 경우도 tylactone 및 desosaminyl tylactone의 생산량이 YJ005 균주와 동일하였다. 추가적으로 YJ005-ccr 균주와 YJ005 균주에 ccr 유전자의 substrate인 crotonate 10mM을 첨가해 주었을 때 두 균주 모두 동일한 2.1배 정도의 생산성 증대를 확인하였다. Crotonate의 첨가를 통한 tylactone 및 desosaminyl tylactone의 생산량의 증대는 ccr 유전자의 도입과 무관하며, 이는 S. venezuelae에서 CCR과 유사한 역할을 하는 효소가 충분히 존재하여 ethylmalonyl-CoA precursor pool을 증가시키고, 나아가 tylactone의 생산량 증대에 기여했을 것으로 추측된다. PikD를 도입한 돌연변이 균주의 경우 tylosin유도체인 tylactone의 생산량이 3.2배 증가 했을 뿐만 아니라 desosaminyl tylactone의 생산량도 18배 이상 증가하였다. 이는 PikD 조절유전자가 PKS 발현 및 desosamine의 당합성 관련 유전자의 전사 (transcription)를 촉진한 결과로 예측된다. 본 연구의 pikD를 도입한 균주의 이러한 결과는 경제적 관점에서 생리활성을 나타내는데 중요한 요소인 당치환체의 증대를 가져왔다는 점에서 높은 이점을 가진다. S. venezuelae에 Tyl PKS이종발현 돌연변이체의 pikD유전자 도입균주의 전사와 단백질 수준에서의 과발현 정도를 확인해 봄으로써 pikD의 과발현을 통한 desosaminyl tylactone의 증대 이유도 밝힐 수 있을 것이다.