Rhodococcus spp. 에 의한 hexane 및 cyclohexane 생분해에 관한 연구

Abstract

As hexane is one of volatile organic compounds (VOCs), it has been used as a solvent for extraction process, cleaning, glue, and ink, and hugely emitted from food and chemical industries or other facilities, resulting in lots of environmental pollution problems. Although the hexane is widely used in the world, the research on the biodegradation of hexane still lacks. This study was a basic experiment for biological treatment of hexane waste gas, so we conducted this study to develop hexane-degrading bacterial resources and characterize them. In this study, we developed two hexane-degrading consortia (consortium OH, consortium CH) using oil-contaminated soils and the isolated two hexane-degrading pure strains (EH741, EH831) from the consortium OH having excellent biodegradation ability. For the results of identifying EH741 and EH831 through the 16S rDNA analysis, two strains belong to Rhodococcus spp., and by comparison of hexane degradation rates by kinetic analysis, EH831 was better in hexane degradability than EH741. Rhodococcus sp. strain EH831, one of our isolates, could use hexane as an sole carbon and energy source, it had the maximum specific hexane degradation rate (Vmax) of 288 μmol·g-DCW-1·h-1. The optimal conditions for biodegrading hexane by Rhodococcus sp. EH831 were at 25～35℃ (temperature), 6～8 (pH), and 10～15 g/L (salt concentration). EH831 is a psychrotroph bacterium that has more than 70% hexane-degrading activity at 10℃, meaning that it may be a useful source for applied bioremediation in groundwater where temperature is usually low. EH831 could mineralize around 49% hexane into CO2 and turn around 46% into the biomass. So we proved that EH831 could degrade almost 95% hexane by using radioisotope experiment. Also, EH831 degraded benzene, toluene, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene, o-xylene, cyclohexane, methyl tert-butyl ether (MTBE), and dichloromethane as well as hexane. The maximum substrate degradation rates of EH831 were 338.7 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in benzene, 283.2 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in toluene, 119.4 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in ethylbenzene, 136.5 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in m-xylene, 212.3 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in p-xylene, and 131.7 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in o-xylene. Meanwhile, they were 202.8 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in methyl tert-butyl ether, 54 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in dichloromethane, 377.4 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in cyclohexane precultured with hexane-BH medium, and 399.1 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 in cyclohexane precultured with cyclohexane-BH medium, showing relatively higher value in the precultured cyclohexane-BH medium. Consequently, EH831 can be a useful biological resource for waste gas treatment of hexane and other various VOCs under a variety of environments. Cyclohexane is a component of petroleum product and known as a recalcitrant compound more than n-alkane or monoaromatic hydrocarbons. As a representative volatile organic compounds (VOC), it is a kind of regulatory VOC in Korea and other countries because it is toxic and harmful. Therefore, it is needed to develop cyclohexane-degrading bacteria for biological treatment. In this study, we succeeded ton develop a cyclohexane-degrading consortium OCC isolated from an oil contaminated soil. 16S rDNA PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) method was used to analyze the bacterial community of consortium OCC. The consortium OCC consists of 3 kinds of bacteria, Rhodococcus spp. (57%), Stenotrophomonas spp. (29%), and Sphingomonas spp. (14%), which are in the phylums of alphaproteobacteria, actinobacteria, and gammaproteobacteria, respectively. Rhodococcus sp. strain EC1 isolated from consortium OCC have an excellent cyclohexane degradability, we measured the maximum specific degradation rates (Vmax) and maximum specific growth rates (μmax) on cyclohexane and hexane. For cyclohexane, Vmax and μmax were 246.4 μmol·g-DCW-1·h-1 and 0.12 h-1 and for hexane, Vmax and μmax were 361.2 μmol·g-DCW-1·h-1and 0.03 h-1, respectively. EC1 could mineralize about 41% hexane into CO2 and convert about 54% into the biomass. We investigated effects of cyclohexane biodegradation under the conditions of temperature, pH, and salt concentration as environmental factors. Optimal conditions of EC1 in cyclohexane biodegradation were 25～35℃ for temperature, 6～8 for pH, and 5～15 g/L for salt concentration. Also, EC1 could degrade benzene, toluene, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene, o-xylene (BTEX), hexane, methyl tert-butyl ether, and pyrene as well as hexane. Consequently, EC1 can be a useful biological resource for bioremediation of hexane and other various hydrocarbons under a variety of environments.;대표적인 휘발성 유기화합물 (VOC)인 hexane은 각종 유기용제 추출공정, 세정제, 접착제, 잉크 등 다양한 산업공정과 제품에서 범용적으로 사용되는 용제로, 여러 산업체 및 시설에서 대량으로 배출되고 있어 많은 환경오염 문제를 유발하고 있다. Hexane은 전 세계적으로 광범위하게 사용됨에도 불구하고, hexane 생분해에 관한 연구는 부족하다. 본 연구에서는 hexane 폐가스의 생물학적 처리를 위한 지식 기반을 구축하기위해, hexane을 효율적으로 분해할 수 있는 미생물 자원 개발 및 특성화에 관한 연구를 수행하였다. Hexane을 효과적으로 분해하는 미생물을 얻기 위해 유류오염 토양을 이용하여 농화배양을 수행하여 hexane 분해 consortium을 2 종류 개발하였고 (consortium OH, consortium CH), 이 중 hexane 분해능이 더 우수한 consortium OH로부터 hexane 분해 순수균을 2 종 (EH741, EH831)분리하였다. EH741과 EH831 균주를 16S rDNA 부분 염기 서열 분석에 의한 동정 결과, 두 균주 모두 Rhodococcus spp.에 속하였고, 속도론적 해석에 의해 hexane 분해 속도를 비교한 결과 EH831 균주가 EH741 균주보다 hexane 분해능이 우수하였다. Rhodococcus sp. EH831은 hexane을 유일탄소ㆍ에너지원으로 이용하였고, 최대 hexane 분해 속도는 288 μmol·g-DCW-1·h-1 이었다. EH831 균주의 hexane 생분해를 위한 최적조건은 온도 25～35℃, pH 6～8, 염농도 10～15 g·L-1 이었다. EH831은 10℃의 저온조건에서도 30℃에서 얻은 hexane 분해 활성의 70% 이상을 유지할 수 있는 psychrotroph로, 저온 조건하에서도 hexane의 생분해가 가능함을 알 수 있었다. 방사선 동위원소 (14C-hexane) 실험을 통해 EH831은 hexane의 49%를 CO2로 무기화하였고, 약 46%는 균체로 전환하여, hexane을 95% 이상 생분해함을 증명하였다. 또한, EH831 균주는 hexane 뿐 아니라 benzene, toluene, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene, o-xylene, cyclohexane, methyl tert-butyl ether, dichloromethane도 분해하였다. EH831의 각 물질별 최대 분해 속도 benzene이 338.7, toluene이 283.2, ethylbenzene이 119.4 μmol·g-DCW-1·h-1이고, m-xylene, p-xylene, o-xylene은 각각 136.5, 212.3, 131.7 μmol·g-DCW-1·h-1이었다. Methyl tert-butyl ether는 202.8 μmol·g-DCW-1·h-1이고, dichloromethane은 54, cyclohexane은 hexane-BH 전배양에서는 377.4 μmol·g-DCW-1·h-1이었고, cyclohexane-BH 전배양에서는 399.1 μmol·g-DCW-1·h-1로 cyclohexane-BH 전배양에서 다소 높은 값을 보였다. 따라서 Rhodococcus sp. EH831 균주는 hexane 외에도 다양한 물질이 포함된 폐가스 처리에 유용한 생물자원임을 알 수 있었다. Cyclohexane은 석유 생산물의 주요 구성 물질로, n-alkane이나 monoaromatic 탄화수소에 비해 분해가 어려운 난분해성 물질로 알려져 있다. 대표적인 휘발성 유기화합물 (VOC)인 cyclohexane은 유독성과 인체위해성 때문에 우리나라를 비롯한 여러 국가에서 유해 VOC 규제 물질로 분류하고 있다. 난분해성 물질인 cyclohexane의 생물학적인 처리를 위해서는 cyclohexane 생분해 균주개발이 시급하다. 본 연구에서는, 유류오염 토양으로부터 cyclohexane을 분해할 수 있는 consortium OCC 개발에 성공하였다. Consortium OCC의 미생물 군집 구조를 알아보기 위해 16S rDNA PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) 분석방법을 이용하였다. Consortium OCC는 Rhodococcus spp.가 약 57%, Stenotrophomonas sp.가 약 29%, Sphingomonas spp.이 약 14%로, alphaproteobacteria, actinobacteria, gammaproteobacteria 등으로 구성되었다. Consortium OCC로부터 cyclohexane 분해능이 우수한 Rhodococcus sp. EC1을 분리하였고, EC1의 cyclohexane 분해능을 평가하고자 농도별 성장속도와 분해속도를 측정하였다. EC1의 cyclohexane 최대 비분해 속도 (Vmax)와 최대 비성장 속도 (μmax)는 각각 246.4 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1와 0.12 h-1이었다. EC1은 cyclohexane 뿐만 아니라 hexane 분해능도 우수하였는데, 최대 hexane 분해 속도는 361.2 μmolㆍg-DCW-1ㆍh-1 이고, 최대 비성장 속도는 0.03 h-1이었다. 또한, 14C-hexane을 이용한 실험에서 hexane의 41%는 CO2로, 54%는 균체로 전환하였다. 환경인자에 따른 cyclohexane 생분해 영향을 조사하고자 다양한 온도, pH, 염농도에서 성장과 분해를 측정하였다. 그 결과, EC1의 cyclohexane 분해 최적조건은 온도 25～35℃, pH는 6～8, 염농도는 5～15 g/L로 나타났다. EC1은 cyclohexane과 hexane 외에 methanol, ethanol, acetone, methyl tert-butyl ether (MTBE), pyrene, diesel, 윤활유, miclean, benzene, toluene, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene, o-xylene (BTEX) 등 타 탄화수소 화합물도 이용 가능하였다. 이처럼 유류로 오염된 토양에서 분리한 EC1은 cyclohexane 뿐 아니라 탄화수소 화합물로 오염된 지하수 및 토양의 생물복원에 유용한 생물자원이 될 것으로 사료된다.